Mục tiêu: Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên hoàn “Kiện não an thần đan’ trên động vật thực nghiệm. Phương pháp: Xác định độc tính cấp bằng phương pháp Litchfield-Wilcoxon trên chuột nhắt trắng chủng Swiss, xác định độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng chủng Wistar theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới. Kết quả: Không phát hiện thấy viên hoàn cứng “Kiện não an thần đan” có độc tính cấp (liều 33,75g/kg/ngày), không xác định được LD50 của thuốc trên chuột nhắt trắng theo đường uống. Sau 4 tuần, chuột cống trắng được uống thuốc thử với liều 0,504g/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương trên người, tính theo hệ số 7) và với liều 1,512g/kg/ngày (gấp 3 lần liều tương đương trên người) không làm ảnh hưởng đến thể trạng, chức năng tạo máu của chuột; không làm thay đổi kết quả đánh giá chức năng gan, thận; không gây tổn thương về hình thái đại thể và vi thể các cơ quan gan, thận chuột. Kết luận: Viên hoàn “Kiện não an thần đan” không gây độc tính cấp và độc tính bán trường diễn trên động vật thực nghiệm.
Từ khóa: Kiện não an thần đan, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn
Summary
STUDY OF ACUTE AND SUB-CHRONIC TOXICITY OF “KIEN NAO AN THAN DAN” TABLETS IN EXPERIMENTAL ANIMALS
Objective: To evaluate the acute and sub-chronic toxicity off “Kien nao an than dan” tablets in experimental animals. Method: The acute toxicity was examined by the Litchfield- Wilcoxon’s method on Swiss white mice. The sub-chronic toxicity was studied following guidance of World Health Organization on Wistar white rats. Results: No acute toxicity at the highest dose of “Kien nao an than dan” (33,75g/kg/per day), the mean lethal dose (LD50) was not identified when applying the experiment on white mice by oral route. After 4 weeks of using “Kien nao an than dan” at 0,504g/kg/per day (equivalent to normal human dosage, calculated based on the coefficient of 7) and at 1,512g/kg/per day (equipment to 3 times of human dosage), white rats had no physical as well as hematological effects. There were no changes on the evaluation of liver and kidney function, no injury on the macro and micro morphology of liver and kidney. Conclusion: The “Kien nao an than dan” tablets did not cause acute and sub-chronic toxicity in experimental animals.
Keywords: Kien nao an than dan, acute toxicity, sub-chronic toxicity
Thiểu năng tuần hoàn não mạn tính (TNTHNMT) là một bệnh hay gặp ở người cao tuổi. Theo Phạm Khuê, danh từ “Thiểu năng tuần hoàn não” dùng để chỉ các biểu hiện do thiếu máu nuôi não. Hiện nay có rất nhiều thuốc cải thiện tuần hoàn não theo những cơ chế tác dụng khác nhau: Làm giãn mạch, làm mở các mạch nối, làm trao đổi chất qua hàng rào máu não được dễ dàng hơn, làm tổ chức não sử dụng glucose và oxy tốt hơn, làm tế bào não chịu đựng tình trạng thiếu máu nuôi được tốt hơn…, tuy nhiên bệnh chưa có thuốc điều trị đặc hiệu và kết quả điều trị chưa lâu dài [1]. Theo y học cổ truyền (YHCT), TNTHNMT được mô tả trong các chứng “huyễn vựng”, “đầu thống”, “thất miên”… với các triệu chứng chủ yếu là: Hoa mắt, chóng mặt, đau đầu, mất ngủ, giảm trí nhớ [2]. Y học cổ truyền đã điều trị chứng bệnh này bằng cách sử dụng các bài thuốc cổ phương và nghiệm phương cùng với các phương pháp không dùng thuốc như: Châm cứu, xoa bóp, bấm huyệt… đã đạt được những kết quả khả quan. Tuy nhiên, dạng thuốc sắc Y học cổ truyền không thuận tiện cho bệnh nhân khi sử dụng, vì vậy chúng tôi bào chế dạng viên hoàn và tiến hành nghiên cứu. Để đánh giá tính an toàn của thuốc, chúng tôi tiến hành nghiên cứu nhằm mục tiêu: Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của viên hoàn “Kiện não an thần đan” trên động vật thực nghiệm.
2.1. Chất liệu nghiên cứu
– Thuốc nghiên cứu: viên hoàn Kiện não an thần đan hàm lượng 0,3g. Sản xuất tại Khoa Dược – Bệnh viện YHCT Thành phố Đà Nẵng. Thành phần gồm:
| STT | Tên dược liệu | Tên khoa học | Hàm lượng (mg) |
| 1 | Đan sâm | Radix Salviae miltiorrhiiae | 200,8 mg |
| 2 | Xích thược | Radix Paeoniae rubra | 167,3 mg |
| 3 | Đương quy | Radix Angenicae sinensis | 220,9 mg |
| 4 | Hồng hoa | Flos Carthami tinctorii | 87,0 mg |
| 5 | Xuyên khung | Rhizoma Ligustici wallichii | 133,9 mg |
| 6 | Ngưu tất | Radix Achyranishi bidentatae | 200,8 mg |
| 7 | Cát cánh | Radix Platycodi grandifloris | 87,0 mg |
| 8 | Sinh địa | Radix Rhemanniae glutinosae | 167,3 mg |
| 9 | Sài hồ | Radix Bupleuri | 87,0 mg |
| 10 | Cam thảo | Radix Glycyrrhizae | 66,9 mg |
| 11 | Chỉ xác | Fructus Citri aurantii | 133,9 mg |
| 12 | Hoè hoa | Flos Styphnolobii japonici | 334,7 mg |
| 13 | Táo nhân | Semen Ziziphi mauritianae | 87,0 mg |
| 14 | Viễn trí | Radix Polygalae | 87,0 mg |
2.2. Đối tượng nghiên cứu
2.2.1. Độc tính cấp
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khỏe mạnh, trọng lượng 20 ± 2 gam , do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp.
2.2.2. Độc tính bán trường diễn
Chuột cống chủng Wistar, giống đực, khỏe mạnh, trọng lượng 180 ± 2gam, do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp. Động vật thực nghiệm được nuôi 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu bằng thức ăn chuẩn dành riêng cho từng loại động vật.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD50 của viên hoàn Kiện não an thần đan trên chuột nhắt trắng theo đường uống bằng phương pháp Litchfield – Wilcoxon và theo hướng dẫn của WHO[3], [4]. Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm. Chuột được chia thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con. Cho chuột uống Kiện não an thần đan với liều tăng dần trong cùng một thể tích để xác định liều thấp nhất gây chết 100% chuột và liều cao nhất không gây chết chuột (gây chết 0% chuột).
Theo dõi tình trạng chung của chuột, quá trình diễn biến bắt đầu có dấu hiệu nhiễm độc và số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc. Tất cả chuột chết được mổ để đánh giá tổn thương đại thể. Từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính để xác định LD50 của thuốc thử. Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống thuốc.
2.3.2. Độc tính bán trường diễn
Đánh giá độc tính bán trường diễn của viên hoàn Kiện não an thần đan trên chuột cống trắng theo đường uống theo hướng dẫn của WHO.
Chuột cống được chia ngẫu nhiên làm 3 lô, mỗi lô 10 con như sau: Lô chứng (uống nước cất liều 1ml/100g thể trọng chuột); lô trị 1 (Uống thuốc liều 0,504g/kg/ ngày -liều có tác dụng tương đương trên người, tính theo hệ số 7); lô trị 2 (Uống thuốc liều 1,512g/kg/ngày- gấp 3 lần lô trị 1). Chuột cống trắng được uống nước hoặc thuốc thử liên tục trong 4 tuần liền, mỗi ngày một lần vào buổi sáng. Sau 4 tuần uống thuốc, chuột được ngừng uống thuốc, đánh giá khả năng gây ra độc tính của thuốc. Các chỉ tiêu theo dõi trước và trong quá trình nghiên cứu trước (T0) , sau 2 tuần (T2) và sau 4 tuần (T4) uống thuốc: tình trạng chung, thể trọng của chuột, đánh giá chức phận tạo máu thông qua số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu, đánh giá chức năng gan thông qua định lượng chất chuyển hoá trong máu, đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: ALT, AST, đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin, ure huyết thanh. Các thông số theo dõi được kiểm tra vào T0, T2, T4. Xét nghiệm huyết học, xét nghiệm sinh hóa được tiến hành tại Bộ môn Sinh lý lao động – Học viện Quân y.
Mô bệnh học: Sau 4 tuần uống thuốc, chuột được mổ để quan sát đại thể toàn bộ các cơ quan, kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể gan, thận của 30% số chuột ở mỗi lô và những chuột có tổn thương đại thể về gan, thận, các xét nghiệm vi thể gan, thận được thực hiện tại Bộ môn Giải phẫu bệnh -Viện 103 – Học viện Quân y.
2.4. Xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được xử lý thống kê theo phương pháp t-test Student. Số liệu được biểu diễn dưới dạng : ± SD. Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Độc tính cấp
Chuột nhắt trắng được uống thuốc thử từ liều thấp nhất tăng dần đến liều 33,75g/kg/ngày nhưng không có chuột nào chết, không xuất hiện triệu chứng bất thường nào trong 72h sau uống thuốc lần đầu và trong suốt 7 ngày. Liều 33,75g/kg là liều tối đa có thể dùng được bằng đường uống để đánh giá độc tính cấp của thuốc thử (nồng độ đặc nhất, thể tích mỗi lần uống tối đa, số lần dùng tối đa trong 24h). So sánh với liều dự kiến trên người là 12 viên hoàn/ngày/50kg (Tính người lớn trưởng thành nặng 50 kg) hay 3,6g/50 kg hay 0,072g/ kg: chuột đã uống đến liều cao gấp 39,06 lần (Tính hệ số ngoại suy trên chuột nhắt trắng là 12) nhưng không xuất hiện độc tính cấp.
3.2. Độc tính bán trường diễn
3.2.1. Tình trạng chung
Trong thời gian thí nghiệm, chuột ở cả 3 lô hoạt động bình thường, nhanh nhẹn, mắt sáng, lông mượt, ăn uống tốt, ngủ tốt, phân khô.
3.2.2. Sự thay đổi trọng lượng chuột
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của viên hoàn Kiện não an thần đan đến trọng lượng chuột
| Thời gian | Lô chứng | Lô trị 1 | Lô trị 2 | p (t-test Student) | |||
| Trọng lượng (g) | % tăng trọng lượng | Trọng lượng (g) | % tăng trọng lượng | Trọng lượng (g) | % tăng trọng lượng | ||
| T0 | 176,5±
6,96 |
176,3±
7,24 |
175,6 ± 6,43 | >0,05 | |||
| T2 | 187,7 ± 7,79 | 6,36 ± 2,32 | 187,6 ± 7,52 | 6,44 ± 2,26 | 188,4 ± 6,67 | 7,32 ± 2,33 | >0,05 |
| P (T0– T2) | < 0,05 | < 0,05 | < 0,05 | ||||
| T4 | 201,2 ± 7,32 | 7,23 ± 1,96 | 202,1 ± 7,80 | 7,74 ± 1,12 | 201,9 ± 7,28 | 7,17 ± 1,41 | >0,05 |
| P(T0 – T4) | < 0,05 | < 0.05 | < 0,05 | ||||
Sau 2 tuần và 4 tuần, trọng lượng chuột ở cả 3 lô (lô chứng và 2 lô trị) đều tăng so với trước khi nghiên cứu, không có sự khác biệt giữa lô chứng và các lô dùng thuốc thử (p > 0,05).
3.2.3. Đánh giá chức năng tạo máu
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của viên hoàn Kiện não an thần đan đến số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu trong máu chuột
| Thời gian | Lô chứng | Lô trị 1 | Lô trị 2 | p
(t- test Student) |
|||||||
| HC (T/L) | BC
(G/L) |
TC
(G/L) |
HC (T/L) | BC
(G/L) |
TC
(G/L) |
HC (T/L) | BC
(G/L) |
TC
(G/L) |
|||
| T0 | 6,66± 0,35 | 8,22 ± 2,54 | 490,40 ± 89,90 | 6,74± 0,43 | 8,02 ± 1,95 | 489,00 ±79,50 | 6,83 ± 0,34 | 8,18 ± 1,99 | 498,22 ± 70,31 | >0,05 | |
| T2 | 6,70 ± 0,69 | 9,15 ± 2,15 | 491,40 ± 83,30 | 6,80± 0,53 | 9,03 ± 1,91 | 507,20 ± 75,36 | 6,99 ± 0,20 | 9,10 ±1,53 | 514,20 ± 76,98 | >0,05 | |
| P (T0– T2) | > 0,05 | > 0,05 | > 0,05 | ||||||||
| T4 | 6,94± 1,00 | 8,75 ± 2,06 | 538,50 ± 78,03 | 6,99± 0,25 | 9,07 ± 1,68 | 515,89 ± 90,05 | 7,07 ± 0,49 | 8,06 ± 1,74 | 533,44 ± 70,84 | >0,05 | |
| P (T0– T4) | > 0,05 | > 0,05 | > 0,05 | ||||||||
Ngoài ra chỉ số hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, công thức bạch cầu không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và so với trước khi uống thuốc thử ( p> 0,05). Sau 2 tuần và 4 tuần, số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và so với trước khi uống thuốc thử ( p> 0,05).
3.2.4. Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan và chức năng thận
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của Viên hoàn Kiện não an thần đan đến hoạt độ AST, ALT trong máu chuột
| Thời gian | Lô chứng | Lô trị 1 | Lô trị 2 | P (t- test Student) | |||
| AST
(U/L) |
ALT
(U/L) |
AST
(U/L) |
ALT
(U/L) |
AST
(U/L) |
ALT
(U/L) |
||
| T0
|
134,68 ± 28,34 | 40,01 ± 4,28 | 137,63 ± 29,05 | 40,88 ± 8,59 | 134,49 ± 20,33 | 45,37 ± 8,18 | > 0,05 |
| T2
|
138,47 ± 19,65 | 45,75 ± 9,55 | 132,08 ± 19,88 | 43,98 ± 9,18 | 129,39 ± 10,56 | 46,88 ± 11,87 | > 0,05 |
| P (T0– T2) | > 0,05 | > 0,05 | > 0,05 | ||||
| T4 | 123,02 ± 26,70 | 42,44 ± 5,83 | 142,87 ± 22,97 | 44,54 ±9,56 | 134,89 ± 20,67 | 41,37 ± 8,09 | > 0,05 |
| P(T0 – T4) | > 0,05 | > 0,05 | > 0,05 | ||||
Sau 2 tuần và 4 tuần, hoạt độ AST, ALT trong máu chuột ở cả 2 lô trị không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và so với trước khi uống thuốc thử (p > 0,05).
| Thời gian | Lô chứng | Lô trị 1 | Lô trị 2 | p
(t- test Student)
|
|||
| Creatinin (µmol/l) | Ure (mmol/l) | Creatinin (µmol/l) | Ure (mmol/l) | Creatinin (µmol/l) | Ure (mmol/l) | ||
| T0 | 64,74 ± 5,82 | 5,26 ± 1,42 | 68,76 ± 8,04 | 5,27 ± 1,35 | 66,39 ± 8,94 | 5,39 ± 0,93 | > 0,05 |
| T2
|
69,02 ± 5,72 | 5,41 ± 1,08 | 66,71 ± 4,96 | 5,21 ± 0,85 | 68,92 ± 6,16 | 5,17 ± 1,20 | > 0,05 |
| P (T0– T2) | > 0,05 | > 0,05 | > 0,05 | ||||
| T4 | 68,72 ± 5,50 | 4,84 ± 1,18 | 69,42 ± 8,85 | 5,07 ± 0,43 | 70,01 ± 6,10 | 5,14 ± 0,78 | > 0,05 |
| P(T0 – T4) | > 0,05 | > 0,05 | > 0,05 | ||||
Sau 2 tuần và 4 tuần, nồng độ Creatinin, Ure trong máu chuột ở cả 2 lô trị không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và so với trước khi uống thuốc thử (p > 0,05).
3.2.5. Kết quả mô bệnh học
Đại thể: Trên tất cả các chuột thực nghiệm (cả lô chứng và 2 lô trị), không quan sát thấy có thay đổi bệnh lý nào về mặt đại thể của các cơ quan tim, phổi, gan, lách, tụy, thận và hệ thống tiêu hoá của chuột cống.
| Chuột số 06 lô chứng | Chuột số 14 lô trị 1 | Chuột số 30 lô trị 2 |
Hình 3.1. Hình thái vi thể gan chuột cống (HE x 200): Cả lô chứng và 2 lô trị đều có hình ảnh cấu trúc gan bình thường
| Chuột số 06 lô chứng | Chuột số 14 lô trị 1 | Chuột số 30 lô trị 2 |
Hình 3.2. Hình thái vi thể thận chuột cống (HE x 200): Cả lô chứng và 2 lô trị đều có hình ảnh cấu trúc gan bình thường
4.1. Độc tính cấp
Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới (WHO), tất cả các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu đều phải đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên thực nghiệm trước khi tiến hành thử nghiệm lâm sàng [4]. Xác định độc tính cấp và LD50 để đánh giá mức độ độc và có cơ sở cho việc chọn liều thử tác dụng cho các bước nghiên cứu tiếp theo. Chuột nhắt trắng đã được uống Kiện não an thần đan ở nồng độ đậm đặc nhất, liều tối đa 0,3375g/10g và số lần tối đa 3 lần/ngày, tương đương 33,75g/kg/ngày và không có biểu hiện độc tính cấp, không xác định được LD50. Về liều lượng thuốc trên thực nghiệm, chuột đã uống thuốc gấp 39,06 lần liều dùng trên người (tính hệ số ngoại suy trên chuột nhắt là 12) nhưng vẫn không có độc tính cấp. Trên thực tế không bao giờ dùng đến liều này.
4.2. Độc tính bán trường diễn
Theo WHO, tình trạng chung, trọng lượng cơ thể và các chỉ số huyết học là những xét nghiệm bắt buộc khi đánh giá độc tính của thuốc thử [4]. Máu liên quan mật thiết với mọi cơ quan trong cơ thể. Về mặt bệnh lý, máu chịu ảnh hưởng của tất cả tổ chức đó và đồng thời cũng phản ánh tình trạng riêng của cơ quan tạo máu [5]. Nếu thuốc có ảnh hưởng đến cơ quan tạo máu thì trước hết các thành phần của máu sẽ bị thay đổi. Vì vậy, các xét nghiệm về số lượng hồng cầu, hàm lượng huyết sắc tố, hematocrit, thể tích trung bình hồng cầu, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu, công thức tiểu cầu của chuột thí nghiệm được xác định. Sau 02 tuần và 04 tuần uống Kiện não an thần đan, các chỉ số trên của chuột ở cả 2 lô trị đều thay đổi không có ý nghĩa so với trước khi dùng thuốc và so với lô chứng ở cùng thời điểm (p > 0,05). Như vậy thuốc Kiện não an thần đan không thể hiện độc tính trên cơ quan tạo máu.
Trong cơ thể, gan đảm nhận rất nhiều chức năng quan trọng. Khi đưa thuốc vào cơ thể có thể gây độc với gan, ảnh hưởng tới chức năng gan. Vì vậy đánh giá độc tính của thuốc đối với chức năng gan là cần thiết [5]. Để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan, người ta thường định lượng nồng độ các enzyme trong huyết thanh có nguồn gốc từ gan. Sự tăng nồng độ các enzym này thường gắn liền với độc tính của thuốc do sự hủy hoại tế bào gan. Trong nghiên cứu của chúng tôi, sau 04 tuần uống thuốc, hoạt độ ALT (alanine amino transferase), ALT (aspartate amino transferase), GGT (Gama glutamyl transferase) và các chỉ số đánh giá chức năng gan (Bilirubin toàn phần, cholesterol toàn phần trong máu) ở cả 2 lô trị đều nằm trong giới hạn bình thường.
Thận là cơ quan bài tiết của cơ thể. Nhu mô thận rất dễ bị tổn thương bởi các chất nội sinh và ngoại sinh [5]. Vì vậy, khi đưa thuốc vào cơ thể có thể gây tổn thương thận, ảnh hưởng đến chức năng thận. Đánh giá chức năng thận sau khi dùng thuốc thường dùng xét nghiệm định lượng ure và creatinin máu. Trong nghiên cứu, nồng độ ure, creatinin trong máu chuột sau khi uống thuốc Kiện não an thần đan không có sự thay đổi khác biệt so với lô chứng và so sánh giữa hai thời điểm trước và sau khi dùng thuốc thử (p > 0,05).
Giải phẫu đại thể và vi thể gan, thận là chỉ số bắt buộc khi đánh giá độc tính bán trường diễn theo hướng dẫn của WHO [4]. Hơn nữa xét nghiệm vi thể là tiêu chuẩn vàng để đánh giá tổn thương 2 cơ quan chính chịu trách nhiệm chuyển hóa và thải trừ thuốc. Trên tất cả các chuột nghiên cứu, không quan sát thấy thay đổi bệnh lý nào về đại thể và vi thể của gan, thận chuột.
Viên hoàn Kiện não an thần đan không gây độc tính cấp trên chuột nhắt trắng theo đường uống khi uống đến liều dung nạp tối đa là 33,75g/kg (gấp 39,06 lần liều dùng dự kiến trên người). Không xác định được LD50 của thuốc thử trên chuột nhắt trắng theo đường uống.
Thuốc Kiện não an thần đan không gây độc tính bán trường diễn trên chuột khi cho chuột uống liều 0,504g/kg/ngày (liều có tác dụng tương đương liều dùng trên người) và liều cao gấp 3 lần (1,512g/kg/ngày) trong 4 tuần liên tục.
Ts.Bs Nguyễn Văn Dũng và Cộng sự
TÀI LIỆU THAM KHẢO
